摘要

• 微波增強的多肽固相合成（SPPS）能夠快速有效地進行大體積氨基酸（如Aib 和N-Me-A）的常規困難偶聯。

• 酰基載體蛋白衍生物 VQAibAibIDYINGOH 和 VQ(N-Me-A) (N-Me-A)IDYING-OH 的合成在 2 小時內完成，純度分別為95% 和 86%。

• GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2 的合成在 3 小時內完成，純度為 89%。

介紹

在許多生物學相關的化合物中都可以找到受阻的非標準氨基酸，例如 α-氨基異丁酸 (Aib) 和 N-甲基丙氨酸 ((N-Me)-A)（圖 1）。^1-3 然而，包括 Aib 或  N-甲基化氨基酸已被證明具有挑戰性；第二個甲基引入的空間位阻，無論是在 α-碳還是酰胺氮上，都使得在常規 SPPS 中偶聯這些氨基酸衍生物變得困難。

圖 1：位阻、非標準氨基酸

然而，通過使用微波增強的SPPS，與受阻非標準氨基酸相關的困難已被小化。在 SPPS 中使用微波能量可以快速有效地完成大體積氨基酸（如 Aib 和 N-甲基丙氨酸）的常規困難偶聯 ^4,5。

材料和方法

試劑

N-α-Fmoc-α-氨基異丁酸獲自 AnaSpec (Freemont, CA)。 Fmoc-N- Me-Ala-OH 獲自 Peptides International (Louisville, KY)。所有其他氨基酸均獲自 CEM Corporation (Matthews, NC)，并含有以下側鏈保護基團：Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser( OtBu) 和 Tyr(tBu) 。Oxyma Pure 和 Rink Amide ProTideTM LL 樹 脂 購 自CEM Corporation (Matthews, NC)。 N,N-二異丙基碳二亞胺 (DIC) 獲 自 CreoSalus (Louisville, KY) 。Fmoc-Gly-Wang Resin LL 購 自NovaBiochem (St. Louis, MO)。哌啶獲自 Alfa Aesar (Ward Hill, MA)。三氟乙saun (TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三異丙基硅烷 (TIS) 和乙酸購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。二氯甲烷 (DCM)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 和無水乙mi (Et2O) 購自 VWR (West Chester, PA) 。HPLC  級 水  (H2O)  和  HPLC  級 乙 腈(MeCN) 購 自 Fisher Scientific (Waltham, MA) 。

多肽合成：GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2

使用CEM Liberty Blue™ 自動微波肽合成儀在Rink Amide ProTide LL 樹脂（離子交換容量： 0.18 meq/g）上以 0.1 mmol規模制備多肽。用哌啶和Oxyma Pure 在DMF中進行脫保護。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure 和5倍過量的Fmoc-AA-OH進行偶聯反應。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統進行切割。裂解后，肽在無水乙mi中沉淀并凍干過夜。

多肽合成： VQAibAibIDYING-OH

使用 CEM Liberty Blue 自動微波肽合成儀在  FmocGly-Wang  LL 樹脂（離子交換容量：0.33  meq/g）上以  0.1  mmol   規模制備肽。用哌啶和  Oxyma  Pure  在  DMF  中進行脫保護。使用DMF 中的 DIC、DMF 中的 Oxyma Pure 和 5 倍過量的 Fmoc- AA-OH 進行偶聯反應。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統進行切割。裂解后，肽在無水乙mi中沉淀并凍干過夜。

多肽合成：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH

使用 CEM Liberty Blue 自動微波肽合成儀在  FmocGly-Wang  LL 樹脂（離子交換容量：0.19  meq/g）上以  0.1  mmol   規模制備肽。用哌啶和  Oxyma  Pure  在  DMF  中進行脫保護。使用DMF 中的 DIC、DMF 中的 Oxyma Pure 和 5 倍過量的 Fmoc- AA-OH 進行偶聯反應。使用具有 TFA/H₂O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統進行切割。裂解后，肽在無水乙mi中沉淀并凍干過夜。

多肽分析

在配備有  PDA  檢測器的   Waters   Acquity   UPLC   系統上分析肽，該檢測器配備 Acquity UPLC  BEH  C8  柱（1.7  mm  和   2.1 x  100  mm）。UPLC  系統連接到  Waters  3100   Single   Quad MS   用于結構測定。在   Waters   MassLynx    軟件上進行峰分析。使用 (i) H₂O 和  (ii)  MeCN  中的  0.1%  TFA  梯度洗脫進行分離。

結果

在Liberty Blue 自動微波肽合成儀上GEQKLGAibAibAibAibASEEDLG-NH2的微波增強  SPPS  產生了  89%  純度的目標肽（圖2）。

圖 2：GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2的HPLC色譜圖

在 Liberty Blue 自動微波肽合成儀上的 VQAibAibIDYING-OH 的微波增強 SPPS 產生了純度為 95% 的目標肽（圖 3）。

圖 3： VQAibAibIDYING-OH的HPLC色譜圖

在Liberty Blue 自動微波肽合成儀上的VQ(N-Me-A)(N-Me- A)IDYING-OH 的微波增強 SPPS 產生了純度為 86% 的目標肽（圖 4）。

圖 4：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的HPLC色譜圖

結論

微波增強的SPPS能夠快速有效的進行大體積氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常規困難偶聯。常規合成GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2 需要40小時且純度 < 10%，但微波增強 SPPS 在 3 小時內產生目標肽且純度為 89%。 此外，酰基載體蛋白衍生物VQAibAibIDYING-OH 和 VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH 的合成在 2 小時內完成，純度分別為 95% 和 86%。 微波增強的 SPPS 已被證明是一種有效的工具，可以大限度地減少SPPS中受阻的非標準氨基酸相關的困難。

參考文獻

[1] Mueller, P.; Rudin, D. O. Nature. 1968, 217, 713–719.

[2] Rebuffat, S.; Goulard, C.; Hlimi, S.; Bodo, B. J. Pept. Sci. 2000, 6, 519–533.

[3] Ahmed, G.; Elger, W.; Meece, F.; Nair, H. B.; Schneider, B.; Wyrwa, R.; Nickisch, K. Bioorg. Med. Chem. 2017, 25, 5569–5575. Collins, J. M. Microwave-Enhanced Synthesis of Peptides, Proteins, and Peptidomimetics. In Microwaves in Organic Synthesis, Third Edition; de la Hoz, A.; Loupy, A.; Wiley-VCH: Weinheim, 2012; 897–959.

[4] Ben Haj Salah, K.; Inguimbert, N. Org. Lett. 2014, 16 (6), 1783–1785.